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pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體，連接酶）說明書

更新時間：2020-12-23　點擊量：1302

pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體，連接酶）說明書

pUC-T Quick Ligation Kit

pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體，連接酶）

目錄號：YJ2591

保存條件：-20℃保存。

組分說明

Cat. No. YJ2591

Size 20次

pUC-T（50 ng/μl） 20 μl

Conctrol Insert (50 ng/μl) 10 μl

Quick T4 DNA Ligase 20 μl

2×Quick Ligation Reaction Buffer 120 μl

本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途

產(chǎn)品簡介

　　pUC-T TA載體是一種克隆PCR產(chǎn)物的載體，它是由pUC18載體在EcoR V

酶切位點處切開，在兩側(cè)的3′端添加T而成。由于大部分耐熱聚合酶反應(yīng)時都會在 PCR

產(chǎn)物的3′端添加一個A，它可以與pUC-T 3′端的T互補連接，因此可大大提高PCR產(chǎn)物的連接和克隆效率。

　試劑盒中配備率的T4 DNA Ligase和為快速DNA連接優(yōu)化的2×Quick Ligation

Reaction Buffer。連接效率相當(dāng)于用T4 DNA Ligase 進(jìn)行常規(guī)連接1小時。帶有插入片

段的重組子可根據(jù)α互補原理，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，判斷載體中有無外源基因的插入?？?/span>

隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

注意事項

1．Insert DNA 要求

1）連接使用的PCR片段3’末端應(yīng)帶有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的 Pfu擴增的PCR產(chǎn)物是平滑末端，可使用加A試劑盒加上A尾后，再進(jìn)行T載體克隆。

2）PCR產(chǎn)物建議進(jìn)行切膠回收純化后再進(jìn)行T載體克隆，以免PCR產(chǎn)物中的非特異片

段或殘存引物等雜質(zhì)影響。推薦使用 YJ2302/YJ0524/YJ0518 快速瓊脂糖凝膠

DNA回收試劑盒。

2．連接反應(yīng)要求

1）本試劑盒能使大多數(shù)連接反應(yīng)在25℃條件下5分鐘甚至更短時間內(nèi)達(dá)到反應(yīng)終點，

增加反應(yīng)時間反應(yīng)效率不會增強。如用快速連接反應(yīng) 1小時后，轉(zhuǎn)化效率會明顯降

低；如25℃快速連接反應(yīng)過約夜，則轉(zhuǎn)化效率會下降到75%。

2）2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混

勻，建議初次使用分裝成小管凍存，避免其反復(fù)凍融影響DNA連接效率。

3）由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易掛壁，建議使用之前短暫離心將

液體收集到管底，取樣時槍頭盡量不要深入液面太深，以免粘在槍頭上造成損失。

4）如快速連接產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)，因快速連接反應(yīng)體系中的PEG會影響電轉(zhuǎn)效率，建議

使用離心柱將連接產(chǎn)物進(jìn)行DNA純化（如YJ2301快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒）后再

進(jìn)行電轉(zhuǎn)。

3．感受態(tài)細(xì)胞要求

建議使用的熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，這樣才可能得到比較理想的陽性克隆，如需

進(jìn)行藍(lán)白篩選，宿主細(xì)胞必須具有正確的基因型（F′編碼的【lacZ ΔM15】）產(chǎn)生ω片

段，才能與載體DNA產(chǎn)生的LacZ α多肽結(jié)合，表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性（α互補）。

pUC-T TA載體以pUC18載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，因此，適合pUC18載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用。推薦使用本公司YJ0807 *0感受態(tài)細(xì)胞、YJ0808 DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

4．陽性克隆篩選

陽性DNA-片段成功插入至pUC-T Vector中后，一般情況下β-半乳糖苷酶的表達(dá)將受

到破壞，重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時將顯示白

色菌落。但有時比較短的DNA-片段插入載體時，基因的讀碼框有可能正好與LacZ的

讀碼框相吻合，克隆體也會顯示藍(lán)色菌落。

5．陽性對照

為了確認(rèn)實驗操作的正確性，以及實驗試劑的有效性，我們建議使用本試劑盒中配

備的Control Insert（750 bp）進(jìn)行陽性對照實驗。

使用方法

1．按以下體系配制反應(yīng)液：

成分反應(yīng)體系對照體系

pUC-T 1 μl 1 μl

DNA插入片段 * 0.1 -0.3 pmol --

Control Insert DNA -- 1 μl

2×Quick Ligation Reaction Buffer 5 μl 5 μl

Quick T4 DNA Ligase 1 μl 1 μl

RNase-Free Water 補足至 10 μl 補足至 10 μl

*Insert DNA的使用量：在進(jìn)行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1:2-1:10，

可根據(jù)實驗情況選擇適當(dāng)?shù)腣ector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比。Insert DNA的使用量=nmol數(shù)×660×Insert DNA bp數(shù)。本載體1 ml（50 ng）的摩爾數(shù)約為0.03 pmol。

2．輕輕混合，短暫離心。25℃反應(yīng)5分鐘。

注意：反應(yīng)時間不要超過15分鐘，否則會降低連接效率。

3．反應(yīng)結(jié)束后，將DNA連接產(chǎn)物存放于0-4℃，而后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗；也可將 DNA連接

產(chǎn)物置于-20℃保存。

注意：勿進(jìn)行加熱失活反應(yīng)。

4．將連接產(chǎn)物加入50 μl感受態(tài)細(xì)胞中（將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化），冰浴30分鐘。

注意：用化學(xué)法轉(zhuǎn)化時，連接產(chǎn)物的加入量不要超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。

5．42℃熱擊45秒鐘，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。

6．加入450 μl無菌SOC或LB培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床，150 rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘，

使菌體復(fù)蘇。

7．根據(jù)實驗要求，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固體

培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于37℃，直至液體被吸收后，

倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12-16小時。

8．計算白、藍(lán)色菌落，挑選白色菌落，使用PCR法或酶切法鑒定插入片段是否正確。

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