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蛋白提取相關知識介紹

蛋白作為生命活動的基本功能單位， 是經典的生物標志物， 常用于蛋白質免疫印跡（Western Blot，WB）、蛋白質免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、染色質免疫沉淀（ChIP）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegel electrophoresis，PAGE）實驗等。為了實現我們的研究目的， 需要將蛋白從細胞組織中提取分離出來， 這一過程即為蛋白提取，提取出高質量的蛋白是后續實驗成功的先決條件。

在分離之前， 需要用一定的方式進行細胞裂解， 細胞裂解方法包括化學裂解、酶裂解和機械裂解。化學裂解和酶裂解（包括SDS和溶菌酶處理等） 通常是比較溫和的方法， 通常會很少使DNA斷裂，是提取純化蛋白時常用的方法。機械裂解可以更均一的裂解細胞， 同化學裂解相比， 機械處理更劇烈和更全面， 具有更高的裂解效率和更低的選擇性，但也會造成DNA的斷裂。

常用的蛋白類型

根據細胞內定位的不同一般可以分為總蛋白、膜蛋白、胞漿蛋白、核蛋白。在提取過程中要注意以下事項：

1. 膜蛋白

通過勻漿適度破碎細胞， 經低速離心去除細胞核和少數未破碎的細胞產生的沉淀， 隨后取上清高速離心獲得細胞膜沉淀和含有細胞漿蛋白的上清， 然后通過優化的膜蛋白抽提試劑從沉淀中抽提獲取膜蛋白。抽提的膜蛋白不僅包括質膜上的膜蛋白，也包括線粒體膜、內質網膜和高爾基體膜等上的膜蛋白。

2. 胞漿蛋白

在低滲透壓條件下， 使細胞充分膨脹， 然后破壞細胞膜， 釋放出細胞漿蛋白，選用合適的抽提試劑進行提取操作。

3. 核蛋白

在低滲透壓條件下， 使細胞充分膨脹破壞細胞膜后， 通過離心得到細胞核沉淀，通過高鹽的細胞核蛋白抽提試劑抽提得到細胞核蛋白。

不同樣本類型的提取方法（以總蛋白為例）

1. 培養的細胞

(1) 貼壁細胞

① 倒掉培養液，將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）；

② 每瓶細胞（一般需要5*10 6細胞） 加預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）清洗后棄去洗液。重復以上操作兩次， 共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈后把培養瓶置于冰上；

③ 每瓶細胞加含PMSF的裂解液， 于冰上充分裂解，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動；

④ 裂解完后， 用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快）， 然后用槍將細胞碎片和裂解液移至新的離心管中（整個操作盡量在冰上進行）；

⑤ 于4℃下12000rpm離心20min。（提前開離心機預冷）；

⑥ 將離心后的上清分裝，于－80℃保存。

(2) 懸浮細胞

離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。

(3) 加藥的貼壁細胞

由于受藥物的影響， 一些細胞脫落下來，所以除按貼壁細胞操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：

① 將培養液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min；

② 棄上清，加入PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次；

③ 用槍吸干上清后， 加100μL裂解液（含PMSF）冰上裂解， 裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解；

④ 將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心20min，取上清分裝并置于－80℃保存。

2. 組織細胞

組織樣品的蛋白抽提時，必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制劑cocktail），操作如下：

(1) 將少量剪碎的組織塊置于玻璃勻漿器中， 加入裂解液裂（含PMSF）進行冰上勻漿。

(2) 充分裂解后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心20min，取上清分裝并置于－80℃保存。

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