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Protein G瓊脂糖凝膠說(shuō)明書

ProteinG-Sepharose

Cat. No.  K0012    

保存：2-8 ℃

組分說(shuō)明

                                     Cat.No.         K0012         K0012A

                                    Volume           1 ml          5 ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

   本產(chǎn)品為Protein G 不 Sepharose 偶聯(lián)后產(chǎn)物，可從血清，腹水，細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動(dòng)物丌同亞型的抗體或包含抗體Fc 片段的基因工程重組蛋白。Protein  G是鏈球菌(group  C和  G)細(xì)胞表面蛋白。它不Protein A 類似，通過(guò)不免疫球蛋白的Fc 區(qū)相互作用，可結(jié)合大多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG。但兩者結(jié)合特異性有所丌同。Protein G 對(duì)人IgG3，小鼠IgG1，大鼠IgG2a 等具有高親和力。天然Protein  G 具有白蛋白和細(xì)胞表面結(jié)合域。重組Protein  G去除了白蛋白和細(xì)胞表面結(jié)合域，以減少非特異性結(jié)合。本產(chǎn)品具有廣譜IgG 結(jié)合、高Fc 段結(jié)合活性、高抗體吸附量和性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，可重復(fù)多次使用。

注意事項(xiàng)

1. 凝膠從冷室或冰箱中取出后在室溫下緩慢振搖恢復(fù)到室溫， 裝柱，避免產(chǎn)生氣泡影響柱效。

2. 裝柱時(shí)盡可能維持凝膠長(zhǎng)徑比為5：3-2：1，長(zhǎng)徑比過(guò)大將導(dǎo)致洗脫峰拖尾，洗脫體積增大；長(zhǎng)徑比過(guò)小將導(dǎo)致樣品不填料接觸時(shí)間短，吸附丌充分，填料吸附蛋白量小。

3. 若上樣液中抗體濃度過(guò)高，應(yīng)使用平衡緩沖液稀釋至1-2mg/ml，以免上樣濃度過(guò)高影響柱效。

4. 可以采用降低上樣時(shí)的流速來(lái)增加樣品不填料接觸時(shí)間從而提高純化抗體量。

5. 凝膠用低pH緩沖液洗脫時(shí)間應(yīng)盡可能短，洗脫后用中性緩沖液盡快中和至pH 中性，以延長(zhǎng)親和介質(zhì)的使用壽命。

6. 洗脫后，應(yīng)立刻用如中和緩沖液將收集到的抗體溶液中和到中性（pH7.4左右），以利于維持抗體的生物活性，避免抗體失活。

7. 填料使用后應(yīng)用0.1M 檸檬酸鈉緩沖液（pH3.0）做再生處理，長(zhǎng)期采用ji端的洗脫條件將縮短親和介質(zhì)的使用壽命。

8. 其它柱再生處理方法：本產(chǎn)品使用10  次以上后先用20%乙醇洗5 個(gè)柱床體積，再用70%乙醇洗脫5-10 個(gè)柱床體積，可洗脫脂類和疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)，避免使親和介質(zhì)的載量下降、干擾親和介質(zhì)的應(yīng)用效果。

操作步驟

I 緩沖液的準(zhǔn)備

1. 平衡緩沖液：20mM       磷酸鹽緩沖液，150mM NaCl，pH 7.4-8.5。

2. 洗脫緩沖液：0.1M glycine, pH2.5-3.0。

3. 再生緩沖液：1M NaCl。

4. 中和緩沖液：1M Tris-Cl，pH9.0。

注意：

1）對(duì)于某些純化載量較少的抗體，可適當(dāng)提高需平衡緩沖液中的鹽濃度（最高可達(dá)3M）和pH 值（最高可達(dá)8.2），以提高抗體和介質(zhì)的吸附力。但是有時(shí)高pH會(huì)使雜蛋白吸附增加，使用者應(yīng)根據(jù)實(shí)際使用狀況適當(dāng)調(diào)節(jié)。  

2）以上緩沖液使用前均需0.45μm濾膜過(guò)濾。

II 樣品的準(zhǔn)備

1. 樣品最+#好用平衡緩沖液稀釋5-10倍，以保證樣品液的成分及pH和平衡緩沖液接近。若上樣體積過(guò)大，可以采取調(diào)節(jié)上樣液pH和鹽濃度的方式，使樣品的pH和電導(dǎo)不平衡液接近，并使樣品中的緩沖體系不平衡緩沖液相同。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)液中大量的血清蛋白會(huì)對(duì)親和層析造成一定的干擾，去血清處理或稀釋樣品將提高純化抗體收率。

注意：樣品在上柱前需0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

III 操作步驟

1. 填料裝柱后，用超純水流洗3-5個(gè)柱床體積以洗掉乙醇，用平衡緩沖液流洗5-10個(gè)柱床體積平衡柱子。

2. 將樣品上柱，上樣流速60cm/h。

3. 平衡緩沖液再洗5-10個(gè)柱床體積，直至基線平穩(wěn)。

4. 洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，用中和緩沖液將洗脫收集樣品中和到中性。

5. 立即用5-10個(gè)柱床體積平衡緩沖液平衡柱子到中性。

6. 再生緩沖液流洗3-5個(gè)柱床體積。先后用純水、20%乙醇分別流洗3-5 個(gè)柱床體積。柱子置于4~8℃保存。

  注意：操作中如果沒(méi)有實(shí)時(shí)的蛋白監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，收集洗脫峰時(shí)可以分階段收集到多個(gè)管中，最后根據(jù)測(cè)定結(jié)果重新調(diào)整收集方式。

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