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Na+ K+-ATP 酶活性測定說明書

更新時間：2019-05-13　點擊量：2773

貨號：YJ2218 規(guī)格：50管/24樣

Na⁺K⁺-ATP 酶活性測定說明書

可見分光光度法

正式測定前務(wù)必取 2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

Na⁺ K⁺- ATP 酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中，可催化ATP水解生成 ADP和無機磷。

測定原理：

Na⁺ K⁺-ATP 酶分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量來確定 ATP 酶活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸

餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×3支，-20℃保存。用時每支加1mL蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃

可保存一周。

試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入 3mL 蒸餾水， 4℃保存。

試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。

試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周。

試劑九：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。

試劑十：10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL標準磷應(yīng)用液配制：將貯備液20倍稀釋，即取0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水

充分混勻。

定磷劑的配制：按 H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品酶液的制備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

操作步驟

1、分光光度計預(yù)熱 30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在 EP 管中加入下列試劑）

	對照管	測定管
試劑一（μL）	130	90
試劑二（μL）	40	40
試劑三（μL）	40	40
試劑四（μL）	40	40
試劑五（μL）		40
樣本（μL）		200
混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）準確水浴 10min
試劑六（μL）	50	50
樣本（μL）	200

混勻，8000g，25℃離心 10min，取上清液

3 定磷(在 1.5mLEP 管中依次加入下列試劑)

	空白管	標準管	對照管	測定管
0.5μmol/ml 標準磷應(yīng)用液（μL）		100
上清液（μL）			100	100
蒸餾水（μL）	100
定磷試劑（μL）	1000	1000	1000	1000